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Countstar® FL在细胞周期定量分析中的应用

 

通过检测DNA上结合染料的含量来判定细胞内DNA的含量一直是细胞周期分析常用的方法。碘化丙啶(Propidium IodidePI)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,常用于细胞周期分析,它是一种溴化乙啶的类似物,在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜,但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。细胞在分裂过程中,不同时期的细胞所含DNA含量不同,如:G0/G1DNA含量为2NG2/MDNA含量为4NSDNA含量为2N~4N之间,

根据DNA上结合染料的荧光强度来判断细胞周期的分布。诺考达唑(Nocodazole)是一种常用的细胞周期阻滞剂,本应用中被用于阻滞MCF7G2期细胞。Countstar® FL 是一款基于图像分析,简洁直观,多功能为一体的细胞分析仪(如图一所示),可以获取准确的细胞周期实验数据,同时也可以通过细胞活力数据分析药物的毒性。

 

1 Countstar® FL 应用点介绍

 

 

材料:

Countstar 产品

Countstar® FL细胞分析仪/Countstar® 样品板/Countstar® 细胞周期检测试剂盒 (CS02001-50)/0.2% 台盼蓝染色液 (CS0101001-50)

其他材料

MCF7 细胞 (ATCC)/诺考达唑 (Sigma-M1404)/DMEM细胞培养基 (Hyclone-SH30243.01)/胎牛血清 (Hyclone-SH30084.03)/胰酶 (Hyclone-SH30042.01)

软件

DeNovo® FCS Express 5 Image/GraphPad Prism5®

方法:

细胞培养基

MCF7 细胞培养在完全培养基中,组成为:500ml DMEM培养基,2 mM L-谷氨酰胺, 1.5 g/L 碳酸氢钠和10% 胎牛血清。

药物处理

1.      MCF7细胞接种在6孔板中,密度为300,000细胞/孔,随后将细胞培养板孵育在37°C, 5% CO2 培养箱中24小时。

2.      24小时后去除旧培养基并加入含有七种不同浓度诺考达唑的新鲜细胞培养液。先将诺考达唑溶解于DMSO中,浓度为400 µM,然后以2.5倍进行梯度稀释,再将七种不同浓度的诺考达唑加入到新鲜培养基中,最高终浓度为400 nM,每个浓度设置一个复孔,另外两个DMSO孔作为阴性对照。继续孵育培养板在37°C, 5% CO2 培养箱中16小时。

染色步骤

1.      细胞活力实验

用台盼蓝染色实验检测不同浓度的诺考达唑对MCF7细胞的毒性作用。去除旧培养基并用PBS洗一次,随后用胰酶进行消化。将重悬后的细胞样品与0.2%台盼蓝溶液1:1混合,随后取20 µl混合液加入到样品板中,并用Countstar® FL内置的台盼蓝程序进行检测。

2.      细胞周期实验

1)  根据细胞活力实验中每个样品的细胞计数结果,制备300,000-500,000个细胞/样品用于细胞周期分析;

2)  将每个样品400 g 离心 5 分钟,吸去上清并用200 µl PBS重悬;

3)  400 g 离心 5 分钟,吸去上清并用200 µl 60%乙醇4°C处理1小时;

4)   400 g 离心 5 分钟,吸去上清并用200 µl PBS洗一次;

5)   400 g 离心 5 分钟,吸去上清并用100 µl 含有1 µl PI0.5 µl RNAse A的细胞周期缓冲液重悬每个样品,在37°C避光条件下孵育30分。取20 µl混合液加入到样品板中,并用Countstar® FL内置的细胞周期程序进行检测。

 

Countstar® FL分析

1.  每个样品的细胞数和细胞活率用内置的台盼蓝计数明场模块进行分析。

细胞周期模块的通道设置为PI红色通道,激发波长为525nM,发射波长为600LP,每个样品采集三个视野。利用Countstar® FL测试完毕后,数据可以导出并用De Novo®FCS Express Image 5软件进行下一步分析(如图2)。

 

 

2. 细胞周期实验过程

 

 

诺考达唑对MCF7细胞的毒性作用

细胞活力实验通常被用于评价抗增殖效果和药物的毒性作用。如图3所示,诺考达唑的毒性作用可用实验组活细胞数/对照组活细胞数的百分比描述,IC50值可通过Graphpad Prism5®软件进行分析计算。

 

3. 诺考达唑对MCF7细胞的毒性作用

 

Countstar® FL 定量分析细胞周期

 

细胞分裂过程中DNA含量的不同可通过结合在DNA上染料的相对荧光强度来决定,本实验中不同浓度的诺考达唑被用于阻滞MCF7的细胞分裂。Countstar® FL的明场分析模块被用于识别每一个细胞,PI通道被用于准确定量每一个细胞,即使样品中含有细胞团也可以准确定量(如图4A)。结果显示诺考达唑明显降低了G0/G1期的细胞数量,轻微降低了S期的细胞数量,相对则明显增加了G2/M的细胞数量(如图4B)。如图4C所示,DMSO(阴性对照),64 nM400 nM 诺考达唑等样品被用于举例说明细胞周期阻滞的分布图。

 

 

 4: A. Countstar® FL上获取的明场通道和PI通道下的视野图像。B. 不同浓度的诺考达唑下各细胞周期的分布曲线。C. DMSO(阴性对照),64 nM400 nM 诺考达唑样品的细胞周期阻滞分布图。

 

总结:

Countstar® FL可用少量的细胞样本即可准确分析细胞周期阻滞剂的剂量依赖效果。FCS Express 5 Image® 软件具有FlowJo® (FlowJo LLC)类似的功能,可用峰形图展示不同细胞周期分布的百分比。相对于其他的分析仪器,Countstar® FL给用户提供了一种稳定,可靠,高性价比的选择。另外,Countstar® FL提供扩展功能,用户可以根据自身需要进行定制。Countstar® FL是一款高度可移动的设备,内置多种预设程序,便于用户快速获取准确,稳定,可高度重现的数据。所有的模块简单易用,大大简化了常规实验室的工作,给客户提供高质量的科研数据。

 

 

 

 

 

 

 

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