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Countstar® FL在抗体亲和力检测中的应用

 

     抗体是自然产生用于帮助免疫系统抵御细胞内外侵害的免疫球蛋白。免疫荧光法测定细胞水平的抗体亲和力大小是评价抗体效果非常重要的指标,Countstar® FL可通过间接免疫荧光法检测不同抗原抗体反应呈现的平均荧光强度直接定量评价抗体亲和力大小,同时也可检测细胞浓度、活率。 此外,可获得细胞图片,实验过程中实时拍摄明场和荧光图像。

Countstar® FL为客户在抗体药物筛选中提供了快速、准确、可靠的抗体亲和力检测方法。


在细胞水平进行抗体亲和力检测的创新方法  



 

 

 

不同抗体梯度稀释添加剂量

选用96孔板测定不同抗体与CHO细胞反应的剂量效应实验,包括原研药、抗体药和阴性对照(图3)。一抗浓度按照下表指示梯度降低(10µg/mL-0.01µg/mL)。 

 

 

                                                                              图 3.  96孔板中抗体浓度. 每孔中有CHO细胞(30万个),

                                                                              二抗(5µg/mL) 及图示一抗 (0.01, 0.039, 0.156, 0.625, 2.5, 10µg/mL). 其他孔为空.


 

Countstar® FL系统图像获取

 

Countstar® FL 内置的抗体亲和力检测程序进行明场,FITC 通道下Alexa Fluor® 488 图像的获取。明场的图像作为一个参考标准对荧光场的图像进行分割,进而获取荧光场的信号。不同浓度梯度A B4,最高浓度 PCK9 和 002-BMK1 样本图像结果如图3所示。

 

                                                              图4. 0.01, 0.039, 0.156, 0.625, 2.5, 10µg/ml AB4与CHO细胞反应后的细胞图像.

                                                          图像显示抗体浓度越高,荧光信号越强. 002-BMK1抗体能特异性的与X蛋白结合,PCSK-9为阴性对照抗体.

                                                          图像代表002-BMK1样品有较强的荧光信号,PCSK-9样品基本没有荧光信号.

 

 抗体亲和力定量分析

 

       不同抗原抗体反应呈现的平均荧光强度直接定量评价抗体亲和力大小。稳定表达 X 蛋白的 CHO 细胞系应用于分析抗体亲和力,Countstar® FL可直接显示测试结果,并将数据导出进行分析。使用 GraphPad Prism5® 对抗体的 EC50 进行分析( Fig. 5A )。测试结果显示样品荧光强度随着一抗浓度升高而增加,平均荧光强度曲线代表不同浓度下每个抗体的反应活性,其中PCSK-9为阴性对照抗体,样品基本没有荧光信号。各抗体的 LogEC50 结果显示原研药的抗体亲和力比仿制药更好,而仿制药中AB2, AB3, AB4, AB6效果较好,可进行下一步实验(Fig. 5B)。Countstar® FL系统为评价抗体亲和力提供直接可靠的结果。



         

               5. 抗体亲和力定量分析结果: A.不同浓度梯度抗体下不同抗原抗体反应中平均荧光强度                     B.原研药和仿制药的分析结果比较







沪ICP备13047873-1号