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Countstar® FL在细胞毒性实验中的应用

 

Countstar® FL在细胞毒性实验中的应用

 

细胞毒性实验用于评估细胞培养的健康状况,评估化合物的毒性,在许多实验室有广泛的开展。用于评估细胞毒性的仪器需要可靠、易于使用和相对快速的特点。Countstar® FL(图1)是一个智能的、直观的细胞分析仪器用于多种细胞实验,包括转染,细胞凋亡,细胞表面标志物,细胞活力,抗体亲和力和细胞周期的评估。该系统提供了强大的荧光定量结果。易于使用的自动化程序指导你完成细胞图像采集到数据分析的过程

 

1 . Countstar® FL系统结合数字显微镜和图像分析功能的台面设备

 

 

材料:

Countstar® 产品/Countstar® FL细胞分析仪/Countstar® 样品板/Countstar® 细胞凋亡检测试剂盒 (CS02002-50)/0.2% 台盼蓝染色液 (CS0101001-50)

 

其他材料

CHO-K1 细胞 (ATCC)/嘌呤霉素 (Gene operation)/DMEM细胞培养基 (Hyclone-SH30243.01)/胎牛血清 (Hyclone-SH30084.03)/胰酶 (Hyclone-SH30042.01)

软件

DeNovo® FCS Express 5 Image/GraphPad Prism5®

方法:

细胞培养基

CHO-K1 细胞培养在完全培养基中,组成为:500ml DMEM培养基,2 mM L-谷氨酰胺, 1.5 g/L 碳酸氢钠和10% 胎牛血清。  

药物处理

1.      CHO-K1细胞接种在6孔板中,密度为200,000细胞/孔,随后将细胞培养板孵育在37°C, 5% CO2 培养箱中24小时。

2.      24小时后去除旧培养基并加入含有不同浓度诺考达唑的新鲜细胞培养液。继续孵育培养板在37°C, 5% CO2 培养箱中48小时。

3.      消化收集细胞

染色步骤:

1)        制备300,000-500,000个细胞/样品用于细胞凋亡分析;

2)        将每个样品400 g 离心 5 分钟,吸去上清并用200 µl PBS重悬;

3)        400 g 离心 5 分钟,吸去上清并用100 µl Annexin V结合液重悬;

4)        每个样品中加入1.5µl Annexin V-FITC4µl 7-AAD,轻轻混匀;

5)        避光孵育10分钟;

6)        400 g 离心 5 分钟,吸去上清并用200 µl PBS重悬,清洗1遍;

7)        吸去上清,用100µl Annexin V结合重悬;

图像获取及数据分析

1.    双荧光模块的程序用于获取FITC7-AAD通道的图像。

2.    每个样品检测3个视野,每个样品重复检测2次。

3.    图像获取完成后,导出数据用FCS软件进行分析。

嘌呤霉素梯度稀释添加剂量

典型抗生素对哺乳动物细胞作用浓度是0.5-10µg/ml嘌呤霉素。嘌呤霉素对细胞作用的梯度剂量(0µg/ml -45µg/ml)如下图所示(图2)。

 

图 2. 每个单孔中添加的嘌呤霉素如上所示 (0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 15, 45 µg/ml) 。

 

 

Countstar® FL FL系统进行图像获取

Countstar FL内置的细胞凋亡检测程序进行明场,FITC, 7-AAD图像的获取。明场的图像作为一个参考标准对荧光场的图像进行分割,进而获取荧光场的信号。0µg/ml 45µg/ml 的处理样本图像结果如图3所示。

 

图 3. 0µg/ml 和45µg/ml 处理的细胞样本图像结果。 左边. 0µg/ml 样本, 有少量的荧光信号。 右边. 45µg/ml 样本, 大部分细胞被FITC和7-AAD同时染色。


 

嘌呤霉素对CHO-K1细胞的杀伤曲线

FCS5软件对结果进行分析,根据荧光强度对细胞群体进行设门(图4A),FCS软件同时提供了单个细胞浏览功能(图 4B),用Graphpad Prism5对嘌呤霉素的IC50进行分析。

 

 

图 4. A. 用FCS5软件对活细胞,早期凋亡细胞,晚期凋亡细胞进行设门分析,随着药物浓度增加,晚期凋亡的细胞逐渐增加。B. FCS5软件可以对每一个象限中的单个细胞进行浏览分析 C. Graphpad Prism5分析嘌呤霉素的IC50结果。

 

总结:

Countstar® FL系统提供了一个快速和容易的方法评价细胞毒性。FCS Express软件提供了查看每一个细胞的功能,通过图像验证数据。此外,它是融合了电子显微镜,图像处理,自动细胞计数于一体的设备。预置多个实验模块,比如细胞周期,细胞凋亡,抗体亲和力,细胞转染,细胞计数,简化了实验室细胞分析任务,同时提供高质量的科学数据。此外,在大规模或者高通量筛选实验之前,Countstar® FL可以提供一个快速的实验结果。

 

 

 

 

 

 

 

 

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