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直接检测PBMC浓度及细胞活率

常规实验的PBMCs计数和活率测定一直是一个复杂和不确定的过程。由于红细胞的存在,使得PBMCs测定的结果受到干扰。通常情况下需要通过2种方式去除红细胞的干扰:1. 将红细胞裂解去除红细胞;2. 密度梯度离心方法去除红细胞。

 

1、红细胞裂解法

      将红细胞裂解的方法是最为常用的方法,这个方法主要利用红细胞较白细胞不耐受低渗溶液的方式将红细胞瞬间裂解以去除红细胞。但是实际上在操作过程中有大量耐受能力较强的红细胞能够幸存,另外一些耐受能力稍弱的白细胞则会受到损伤。

2、密度梯度离心法
      密度梯度离心方法是最为温和的去除红细胞的方法,但是这种办法也无法去除残存的红细胞。    

 

 

  

密度梯度离心法分离得到PBMC 背景复杂,很难区分其中的PBMC

 

 

台盼蓝计数法,无法排除其中混入的红细胞

 

 

Countstar FL提供了一种更加简便和准确的PBMCs的分析方法,可是使用户在不裂解红细胞的情况下即可对PBMCs进行分析。

活死单个核细胞可呈现荧光信号。而成熟的红细胞及血小板,因为没有细胞核,不能被AO/PI染色,因此可以完全被排除在外不被计数。可以精确计数分离后的PBMC以及活力分析。  

                       

虽然有研究者使用2种方法的组合来去除红细胞,但是同样被证明无法完全去除红细胞。现在的研究者在PBMCs研究中遇到的挑战:研究者们依然在使用传统的血球计数板分析PBMCs细胞;在分析的时候会PBMCs会受到红细胞的干扰;红细胞仅能用肉眼识别,并且需要有一定经验的实验者;

 

 

血细胞经PBS稀释后,在明场条件下,因为有大量的红细胞,血浆等干扰,无法进行计数,双荧光法可明显识别PBMC。


 




梯度稀释后测定PBMCs浓度

血细胞,用PBS稀释不同比例(1:5,1:10,1:15,1:20,1:25),使用AO/PI染色方法染色并在Countstar仪器上进行检测。结果如图所示。经过稀释后,可以看到检测结果拥有良好的线性。 

 

双荧光法对密度梯度离心法获得PBMC进行计数


双荧光法可准确区分密度梯度离心后PBMC的死活,并有效排除干扰物质对细胞计数的影响    


双荧光法对密度梯度离心法获得PBMC进行计数

 

 

                    对PBMC进行梯度稀释后,Countstar对浓度的测试具有很好的线性       对PBMC进行梯度稀释后,Countstar®对活率的测定具有很好的一致性


 

Countstar测试结果显示界面







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